1. Genopretning
●1. Tag kryovialet ud af det flydende nitrogen, kom det straks i et 37 graders vandbad, og ryst det let. Efter at væsken er smeltet (ca. 1-1,5 minutter), tages den ud og sprøjtes lidt alkohol og lægges på det ultra-rene arbejdsbord.
●2. Aspirer ovenstående cellesuspension ind i et 15 ml centrifugerør fyldt med 10 ml medium (vask kryokonserveringsrøret med medium for at vaske alle cellerne, der klæber til væggen), og centrifuger ved 1000 rpm i 5 minutter.
●3. Hæld supernatanten fra og tilsæt 1 ml medium for at suspendere cellerne. Aspireres i en 10 cm petriskål indeholdende 10 ml dyrkningsmedium og rystes forsigtigt frem og tilbage for at få cellerne i petriskålen jævnt fordelt.
●4. Mærk celletype og dato, navnet på kultivatoren osv., og placer den i en CO2-inkubator til dyrkning. Efter at cellerne klæber til væggen, skal du skifte mediet.
●5. Skift mediet hver 3. dag.
2. Passering
●1. Passage når celledækningen i kulturskålen når 80 procent -90 procent .
●2. Aspirer det originale medium.
●3. Tilføj passende trypsin (bare nok til at dække cellerne) og fordøj i 1-2 minutter.
●4. Efter at cellerne er afrundet, tilsæt et lige så stort volumen serumholdigt medium for at afslutte fordøjelsen.
●5. Brug en pipette til at suspendere cellerne ved pipettering.
●6. Aspirer cellerne ind i et 15 ml centrifugerør og centrifuger ved 1000 rpm i 5 minutter.
●7. Hæld supernatanten fra, tilsæt 1-2ml medium, og spræng cellerne i luften.
●8. Overfør cellerne til flere retter afhængigt af celletypen. Generelt er der 5 kræftceller og 3 normale celler. Fortsæt med at dyrke.
3. Kryokonservering Fordøj cellerne og centrifuger (ibid.). Suspender cellerne med den forberedte fryseopløsning, og fordel dem i steriliserede kryoglas, lad dem stå i et par minutter, og angiv celletype og kryokonserveringsdato. 4 grader i 30 minutter, -20 grader i 30 minutter, -80 grader natten over og anbringes derefter i flydende nitrogen til opbevaring. Fremstilling af kryokonserveringsopløsning: 70 procent komplet medium plus 20 procent FBS plus 10 procent DMSO. DMSO skal langsomt tilsættes dråbevis, mens der rystes, mens der dryppes.
