Da du lige er færdiguddannet og er gået ind i jobbet, står du over for en masse navneord, der står over for kvantitative PCR-eksperimenter i realtid. Er du i tvivl om, hvor du skal starte? Hvad er betydningen af amplifikationskurve, standardkurve, tærskelværdi, CT-værdi, smeltekurve og baseline? De fluorescerende billeder fra disse eksperimenter er for lyse, men jeg kan tilsyneladende ikke identificere dem. I dag vil vi tage dig med til at lære denne viden og begreber i to dele: tekniske termer og ofte stillede spørgsmål.
Del I Professionelle vilkår
1. Amplifikationskurve
Amplifikationskurven refererer til kurven, hvor cyklusnummeret er abscissen, og fluorescensintensiteten i realtid under reaktionen er ordinaten under PCR.
2. Grundlinje
Baseline refererer til lille ændring i fluorescerende signal under de første par cyklusser af en PCR-amplifikationsreaktion. Signalniveauet viser tæt på en lige linje, som er basislinjen.
3. Indstilling af fluorescenstærskel
Typisk bruges fluorescenssignalet fra de første 15 cyklusser af PCR-reaktionen som fluorescensbaggrundssignalet, og fluorescenstærsklen er 10 gange standardafvigelsen af fluorescenssignalet under 3-15 PCR-cyklusser og fluorescenstærsklen indstilles under den eksponentielle fase af PCR-amplifikation. Typisk har hvert instrument sin fluorescenstærskel før brug.
4. CT-værdi
CT-værdien repræsenterer antallet af cyklusser, der vil forekomme for hvert PCR-reaktionsrør, når det fluorescerende signal når den indstillede tærskel. Fra forskning ved vi, at der er et lineært forhold mellem CT-værdien af hver skabelon og logaritmen af startnummeret for den pågældende skabelon. Jo højere det oprindelige kopinummer er, jo mindre er CT-værdien og omvendt. Ved brug af standarder med kendte startkopital kan der laves en kalibreringskurve, hvor abscissen repræsenterer startkopitallets logaritme, mens ordinaten repræsenterer CT-værdien. Så længe CT-værdien af den ukendte prøve er opnået, kan det oprindelige kopinummer for prøven derfor beregnes ud fra standardkurven.
vide mere
Der er flere indikatorer til at bedømme, om amplifikationskurven er god eller ej:
Svar: Kurvens bøjningspunkt er indlysende, især den eksponentielle fase af den lavtunge fraktionsprøve er indlysende, den overordnede parallelitet af amplifikationskurven er meget god, basislinjen er flad, der er intet stigende fænomen, og forstærkningen kurven for den eksponentielle fasekoncentrationsprøve på lavt niveau er meget god. indlysende.
B: Hældningen af den eksponentielle fase af kurven er direkte proportional med amplifikationseffektiviteten, jo større hældningen er, desto højere er amplifikationseffektiviteten.
C: Standardbasislinjen er flad eller svagt faldende uden nogen synlig opadgående tendens.
D: Paralleliteten af amplifikationskurverne for hvert rør er god, hvilket indikerer, at amplifikationseffektiviteten af hvert reaktionsrør er ens.
5. Smeltekurve
Når PCR-produktet opvarmes, efterhånden som temperaturen stiger, dissocieres det dobbeltstrengede amplifikationsprodukt gradvist, hvilket resulterer i et fald i fluorescensintensiteten. Når en vis temperatur er nået, adskilles en stor mængde produkt, hvilket resulterer i et kraftigt fald i fluorescens. Brug af denne funktion sammen med forskellige TM-værdier for forskellige PCR-produkter adskiller sig også i den temperatur, ved hvilken det fluorescerende signal hurtigt falder, hvilket kan være en god måde at identificere PCR-specificitet.
6. Smeltekurve (ved hjælp af logaritmisk kurve)
Topgrafen er dannet af logaritmen af smeltekurven for mere intuitivt at vise situationen for produktfragmenter. Da smeltetemperaturen er TM-værdien af et DNA-fragment, kan visse parametre, der påvirker TM-værdien af et DNA-fragment, bestemmes, såsom fragmentstørrelse, GC-indhold osv. Generelt siger man i henhold til vores primer-designprincip. at længden af det forstærkede produkt er i området 80-300bp, og smeltetemperaturen skal være mellem 80 grader og 90 grader .
A: Hvis der kun er én hovedtop mellem 80 grader og 90 grader, betyder det, at real-time PCR er perfekt.
B: Hvis hovedtoppen forekommer mellem 80 grader og 90 grader, og urenhedstoppen vises under 80 grader, overvejes primer-dimeren grundlæggende. Dette er en god mulighed for at prøve at løse ved at hæve udglødningstemperaturen.
C: Hvis hovedtoppen viser sig mellem 80 grader og 90 grader, og der vises en vandrende top, når temperaturen stiger, overvejes DNA-kontaminering som udgangspunkt. Og DNA'et skal fjernes i de indledende faser af eksperimentet.
7. Standard kurvelinje
Standardstandarder blev fortyndet til forskellige koncentrationer og brugt som skabeloner til PCR-reaktioner. Standardkurven er plottet med logaritmen af standardkopitallet som abscisse og den målte CT-værdi som ordinat. Ved kvantificering af en ukendt prøve kan prøvens kopinummer fås fra standardkurven baseret på CT-værdien af den ukendte prøve. Standardkurver er meget vigtige for absolut kvantificering.
anden del. almindeligt problem
Q1: Hvad er forskellen mellem RT-PCR, QPCR, real-time PCR og real-time RT-PCR?
A1: RT-PCR er revers transkriptions-PCR, som er en meget anvendt variant af polymerasekædereaktion. I RT-PCR bliver RNA-strengen omvendt transkriberet til komplementært DNA, som derefter bruges som en skabelon for PCR til at amplificere DNA'et ved PCR.
Real-time PCR og QPCR er det samme, begge er real-time kvantitativ PCR, hvilket betyder, at der er real-time registrering af data ved hver cyklus under PCR processen. På denne måde kan antallet af opstartsskabeloner analyseres præcist.
Selvom både real-time PCR og revers-transcription PCR ser ud til at blive forkortet til RT-PCR, er den internationale konvention, at RT-PCR refererer specifikt til revers-transcription PCR, mens real-time PCR ofte forkortes til qPCR (Quantitative Real- True Real-True Real PCR ) - tids-PCR).
Real-time RT-PCR (RT-QPCR) er en type revers transkription PCR, der kombinerer fluorescerende kvantitative teknikker: først revers transkription fra RNA for at opnå cDNA (RT), efterfulgt af kvantitativ analyse ved brug af real-time PCR (QPCR).
Spørgsmål 2: Hvorfor er længden af det amplificerede produktfragment af fluorescerende kvantitativ PCR kontrolleret inden for området på 80-300bp?
A2: Længden af hver gensekvens er forskellig, nogle af dem er flere Kb og hundredvis af BP. Men når vi designer primeren, behøver vi kun at kræve, at produktets længde er 80-300bp, og for kort eller for lang er ikke egnet til kvantitativ PCR-detektion.
Produktfragmenter er for korte til at kunne skelnes fra primer-dimerer. Længden af primer-dimeren er ca. 30-40bp, når den er mindre end 80bp, er det svært at skelne, om det er en primer-dimer eller et produkt. Hvis produktfragmentet er for langt og overstiger 300 bp, vil det let føre til lav amplifikationseffektivitet, og mængden af gen kan ikke detekteres effektivt.
Når du for eksempel tæller antallet af personer i et klasseværelse, skal du kun tælle, hvor mange munde der er. Det samme gælder, når man tester gener. Du behøver kun at detektere en bestemt sekvens af et gen for at repræsentere hele sekvensen. Det er nemt at lave en fejl, hvis du tæller både munde og næser, ører og briller for at tælle folk.
Q3: Hvad er den optimale længde for primerdesignet?
A3: Generelt set er primerlængder i området 20-24bp gode. Selvfølgelig skal vi være opmærksomme på primerens TM-værdi, når primeren designes, fordi det er relateret til den optimale annealingstemperatur. Efter mange forsøg er det blevet bevist, at 60 grader er en god TM værdi. Lav annealingstemperatur kan nemt føre til uspecifik amplifikation, mens høj annealingstemperatur normalt fører til lav amplifikationseffektivitet, sen top af amplifikationskurven og forsinket CT-værdi.
Spørgsmål 4: Påvirker mængden af indsamlet prøve de eksperimentelle resultater?
A4: Nej. Jo flere prøver der indsamles, jo mere RNA ekstraheres, jo mere cDNA, og jo flere målfragmenter vil der være. For absolut kvantificering er det nødvendigt at beregne kopinummeret af målfragmentet, og mængden af indsamlet prøve vil helt sikkert påvirke de eksperimentelle resultater. For eksempel er påvisningen af hepatitis C-virus HBV i blodet at påvise HBV-indholdet i en vis mængde (1 ml) blod.
For relativ kvantificering, der almindeligvis anvendes i videnskabelig forskning, har antallet af prøver intet at gøre med de eksperimentelle resultater, fordi relativ kvantificering refererer til sammenligningen mellem målgenet og referencegenet. Bare betragte dem som opstrøms- og nedstrømsfragmenter, der er til stede i den samme nukleinsyrestreng. Hvis prøvestørrelsen er stor, øges både reference- og målgener i lige store forhold på samme tid, hvilket ikke påvirker resultaterne.
Spørgsmål 5: Vil effektiviteten af revers transkriptase påvirke de eksperimentelle resultater?
A5: Samme som ovenfor. Bemærk, at vi ønsker højere RT-effektivitet, men vi foretrækker, at RT-enzymet er relativt stabilt og opnår ensartede resultater. Dette vil være en test af de optimerede muligheder i de store virksomheders reverse transcription suiter.
Spørgsmål 6: Påvirker effektiviteten af TAQ-enzymet de eksperimentelle resultater?
A6: Effektiviteten af TAQ-enzym er relativt stor. Typisk kræves hot-start taq-enzymer og er relativt effektive. For kommercielle fluorescens kvantitative kits, vil hver producent optimere effektiviteten af den bedste tilstand i henhold til deres egne produkter tæt på 100 procent, hvis effektiviteten er for lav, kan de eksperimentelle resultater ikke opnås. For forskellige virksomheders produkter er dette et mål for kvalitet.
Spørgsmål 7: Påvirker mængden af fluorescerende farvestof de eksperimentelle resultater?
A7: Ja, det vil det. Hvis fluorokromen er for mættet, kan det forårsage støjinterferens i nogle instrumenter. Hvis fluorokromen ikke er mættet, og fluorescensværdien er for lav, vil den gå tidligt ind i en plateaufase, og amplifikationskurven vil være flad. I det fluorescens kvantitative eksperiment ses hovedsageligt CT-værdien, så det er ikke vigtigt for den sene amplifikationskurve at komme ind på plateaustadiet, men billedet er ikke smukt nok. Hvis du skulle vælge, så start med at vælge en fluorokrom, der er lidt mindre mættet. Men når man bruger det samme produkt fra samme virksomhed, er dets virkning stort set ubetydelig.
Spørgsmål 8: Vil transmissionen af PCR-røret påvirke forsøgsresultaterne?
A8: Ja. For det samme parti forbrugsvarer fra samme producent kan denne effekt dog ignoreres. Dette er et godt valg, og det er bedst at bruge en 96-brøndplade med en højpermeabilitetsmembran for at minimere effekten af forbrugsmaterialernes lystransmittans.
Q9: Vil fejl under drift påvirke forsøgsresultaterne?
A9: Påvirkningen af operationsprocessen afspejles hovedsageligt i ensartetheden. Homogenitet betyder, at alle komponenter i systemet er jævnt blandet sammen, og flashcentrifugering kan løse dette problem. Derudover er det for begyndere bedst at justere PCR-systemet til at være mere end 20 tommer, og et system, der er for lille, er mere udsat for fejl. Hvis annealingstemperaturen er optimeret korrekt, minimeres effekten af primerkoncentration på CT. Og du ved, at nogle driftsfejl (såsom primerkoncentration) kan undgås ved at optimere udglødningstemperaturen.
Sammenfatte
Ovenstående er nogle spørgsmål og spørgsmål, som begyndere ofte støder på under eksperimentet, vi håber, at disse spørgsmål kan hjælpe dig med at løse en vis forvirring. Eksperimentering er processen med at skabe kaos og løse problemer, forhåbentlig får du noget ud af det. Tak fordi du læste med, og vi ses næste gang!
