Hvad er cellekultur?
cellekultur
Cellekultur refererer til processen med at dyrke celler under kontrollerede forhold uden for deres naturlige miljø. Det er et in vitro-værktøj, der letter forståelsen af cellebiologi og sygdomsmekanismer. Det spiller også en rolle i lægemiddelopdagelse, såsom lægemiddeltoksicitetstestning og farmakokinetiske/farmakodynamiske undersøgelser, såvel som personlig medicin.
Den amerikanske embryolog Ross Granville Harrison udviklede de første in vitro cellekulturteknikker i det tidlige 20. århundrede, da han med succes dyrkede vævsfragmenter fra frøembryoner in vitro. I dag har cellekultur hjulpet med utallige opdagelser, såsom udvikling af vacciner mod polio, mæslinger, fåresyge og andre infektionssygdomme.
Adhæsions- og suspensionskultur
Der er to grundlæggende systemer til cellevækst: adhærent kultur og suspensionskultur. Adhærente kulturer dyrkes på kunstige substrater, mens celler i suspensionskulturer flyder frit i mediet. Mens kun få celletyper vokser naturligt i suspension (f.eks. lymfocytter), kan mange adhærente celletyper tilpasses til suspensionskultur.
Der er to grunde til at dyrke naturligt klæbende celler i suspension. Den første fordel ved suspensionskultur er, at celler er nemmere at passere, fordi du ikke behøver at enzymatisk eller mekanisk adskille dem fra dyrkningskarret. For det andet er suspensionskulturer lettere at opskalere, fordi cellevækst kun er begrænset af deres koncentration i mediet, ikke af det tilgængelige overfladeareal. Den største ulempe ved suspensionskulturer er, at de kræver daglige celletællinger og levedygtighedsassays for at følge vækstmønstre, hvorimod adhærente kulturer let kan undersøges under et mikroskop.
2D og 3D metoder
Adhærente kulturer kan yderligere opdeles i 2D- og 3D-kulturer. I 2D-applikationer dyrkes adhærente celler i et monolagssystem på en flad overflade, såsom i en cellekulturkolbe.
cellekultur
På grund af sin enkelhed kan 2D-teknologi ikke efterligne in vivo-miljøet af celler, som typisk vokser i tredimensionelle strukturer med komplekse celle-til-celle-interaktioner. Det er grunden til, at nogle eksperimenter udføres ved hjælp af 3D-kulturer, der kan dyrkes ved hjælp af stilladsbaserede eller stilladsfrie teknologier.
Stilladsbaserede 3D-metoder involverer typisk dyrkning af adhærente celler i hydrogelstilladser. Alternativer såsom biokeramiske, metal- eller polymerstilladser bruges også til nogle applikationer.
Stilladsfri teknikker bruges til at dyrke sfæroider ved en af tre forskellige metoder:
Forceret flydning: Fyld cellesuspensionen i brøndene på en polymer-coatet mikroplade med lav vedhæftning. Mikropladen centrifugeres derefter for at tvinge cellerne til at danne sfæroider.
Hængende dråbe: Cellesuspensionen fyldes i brøndene på en hængende dråbeplade. Som navnet antyder, vil suspensionen hænge på pladen som dråber. Celler vil aggregere ved spidserne af disse dråber og danne kugler.
Omrøringsbaseret: Cellesuspensionen placeres i en roterende bioreaktor. På grund af den konstante omrøring var cellerne ude af stand til at klæbe til væggene og dannede således sfæroider.
Cellekulturudfordring
På trods af forskellene i metoder og teknikker har alle eksperimenter én ting til fælles: Det er svært at dyrke levende celler i det nødvendige antal for at opnå reproducerbare resultater. Derfor vil de følgende afsnit blive afsat til fire udfordringer - repeterbarhed, forurening, gennemførlighed og overgangen til automatisering.
reproducerbarhed
Ifølge en undersøgelse foretaget af Yongyue Medical rapporterede mere end 70 procent af forskerne, at de undlod at reproducere en anden videnskabsmands eksperimenter, og mere end halvdelen undlod at reproducere deres eget arbejde. I cellekulturassays opstår de fleste reproducerbarhedsproblemer fra biologiske forskelle mellem cellepassager eller generationer. Et andet stort problem er fejlidentifikationen af cellelinjer, og uoverensstemmelser i kulturparametre spiller også en vigtig rolle.
biologisk variation
Faktorer som tilfældige mutationer eller transkriptionsfejl har potentiale til at påvirke reproducerbarheden af eksperimenter, hver gang en celle deler sig. For at undgå dette bør du oprette en cellebank i begyndelsen af et nyt projekt.
cellebank
Cellebank refererer til processen med at gemme batches af specifikke celletyper til senere brug for at undgå faktorer som tilfældige mutationer eller transskriptionsfejl, der påvirker reproducerbarheden. Det første trin er at etablere en mastercellebank (MBC) ved at dyrke udvalgte celletyper af interesse for kultur og kryokonservere dem i flere beholdere. MBC-batcher optøs og bruges senere til at forberede arbejdscellebanker (WBC'er).
Fejlidentifikation af cellelinjer
Problemet med fejlidentifikation af cellelinjer har været kendt siden 1960'erne, hvor en videnskabsmand beskrev HeLa-cellekontamination af 19 andre humane cellelinjer. For at sikre, at dine resultater er pålidelige, og endnu vigtigere, at du ikke drager falske konklusioner, bør du sætte alle nye cellelinjer, der kommer ind i laboratoriet, i karantæne, indtil deres oprindelse er blevet bekræftet. Vigtigst er det, at det anbefales at gentage cellelinjekvalifikationen før kryokonservering og distribution til andre laboratorier og efter projektet er afsluttet. For at bekræfte en cellelinje skal du først kontrollere, om den er opført i det forkert identificerede cellelinjeregister. Hvis det ikke er registreret, skal du stadig bekræfte dets ægthed. For humane cellelinjer anbefales kort tandem-gentagelse (STR)-analyse (DNA-fingeraftryk). En række forskellige testmetoder er tilgængelige for ikke-humane cellelinjer, herunder karyotyping, isoenzymanalyse og mitokondriel DNA-typning (DNA-stregkodning).
Kulturparametre
En tredje faktor, der påvirker reproducerbarheden, er dyrkningsparametre.
For eksempel kan iltniveauer i væsentlig grad påvirke dyrkede celler. Variabler, der påvirker iltning, såsom kammerstørrelse eller celletæthed, er dog ikke altid dokumenterede og kan derfor ikke holdes konsistente.
En anden vigtig kulturparameter er mediet. Dette giver essentielle næringsstoffer, vækstfaktorer og hormoner og regulerer pH og osmotisk tryk. Derfor er det vigtigste, at dens sammensætning altid er den samme. Dette er især kritisk for medium formuleringer suppleret med føtalt bovint serum (FBS), hvis sammensætning afhænger af faktorer såsom koens kost, geografiske placering og tidspunkt på året. For at minimere effekten af FBS på reproducerbarheden af resultater, bør du bestille forskellige partier af serum, når de nuværende lagre begynder at løbe tør, og teste dem for at finde det tætteste match. For at andre kan gengive dine resultater, bør du rapportere, hvordan du screenede serumet og registrere lotnummeret.
cellekultur
Cellebehandling
De fleste forskere ved, at kulturparametre har en enorm indflydelse på deres applikationer, men ændringer i forarbejdningsteknikker bliver ofte overset.
Forurening
Når celler isoleres fra væv og dyrkes i laboratoriet, er de ikke længere beskyttet af immunsystemet og er derfor ekstremt sårbare over for kontaminering.
Den første kilde til kontaminering er abiotiske kontaminanter såsom urenheder i dyrkningsmediet, serum, kosttilskud eller vand, samt endotoksiner og udvaskelige stoffer. Forholdsregler omfatter brugen af laboratorievand til cellekultureksperimenter og medier, serum, kosttilskud og forbrugsvarer fra producenter, der tilbyder endotoksintestcertificering. Derudover skal forbrugsstoffer være lavet af ny polystyren eller polypropylen for at sikre, at plasttilsætningsstoffer ikke siver ind i din cellekultur.
Den anden kilde til forurening er biologiske kontaminanter såsom bakterier (herunder mycoplasma), svampe og gær.
gennemførlighed
Cellelevedygtighed er defineret som andelen af levedygtige celler i en prøve. Ud over de forurenende stoffer, vi lige har set, er der forskellige andre faktorer, der påvirker cellernes levedygtighed. Miljøforhold - temperatur, pH, osmotisk tryk, tilgængelighed af næringsstoffer og O2- og CO2-koncentrationer - er meget vigtige. De fleste af disse variable er styret af mediet og er celletypespecifikke, hvilket desværre betyder, at vi ikke kan give specifikke retningslinjer.
Da celler er meget følsomme over for tryk, bør du ikke kun være opmærksom på miljøforhold, men også på dine væskehåndteringsteknikker.
En sidste faktor, der påvirker cellernes levedygtighed, er senescens. De fleste finite cellelinjer overlever 20 til 60 delinger før de dør, hvilket betyder, at de kun kan genbruges mellem 15 og 45 generationer. Bagefter skal den kryokonserverede prøve optøs fra cellebanken. Kontinuerlige cellelinjer kan formere sig på ubestemt tid, men fordi de er tilbøjelige til genetisk drift, bør de udskiftes regelmæssigt.
Detektionsassays ved hjælp af kolorimetriske, fluorometriske og bioluminescerende metoder kan bruges til at måle cellelevedygtighed. En almindeligt anvendt kolorimetrisk metode er MTT-metoden, som er baseret på reduktion af gule tetrazoliumsalte til lilla formazankrystaller af levende celler.
96-brøndplader
automatisering
Mange af de ovenfor beskrevne udfordringer kan løses ved at automatisere cellekulturarbejdsgange. For eksempel vil cellehåndtering altid være konsekvent, hvilket positivt påvirker reproducerbarheden og levedygtigheden. Det vigtigste er, at automatisering reducerer risikoen for brugerkontamination.
På trods af disse fordele kan automatisering af hele arbejdsgange være udfordrende på grund af budgetmæssige årsager, mangel på plads til robotter, eller fordi der ikke er nok ressourcer til at automatisere og validere hvert trin på én gang. Men dette kan løses!
