PCR-teknologi skal have kunstigt syntetiserede rimelige primere og ekstraheret prøve-DNA og derefter udføre automatisk termisk cykling og til sidst udføre produktidentifikation og analyse. På nuværende tidspunkt kan primerdesign og -syntese kun udføres i få forskningsinstitutter, institutter og klinikker med stærk teknisk styrke. Applikationen behøver kun at købe PCR-detektionskittet for at starte arbejdet. Der er mange faktorer, der påvirker PCR-automatikkens termiske cyklus. For forskellige DNA-prøver er mængden af forskellige komponenter tilsat i PCR-reaktionen og temperaturcyklusparametrene inkonsistente.
Flere hovedpåvirkningsfaktorer introduceres nu som følger.
En, temperaturcyklusparametre
I den automatiske PCR-termiske cyklus er den mest kritiske faktor temperaturen for denaturering og annealing. Som vist i operationseksemplet er betingelserne for denaturering, annealing og forlængelse: 94℃60s, 37℃60s, 72℃120s, i alt 25~30 A cyklus, det amplificerede fragment er 500bp. Her skal tiden for hvert trin beregnes, efter at reaktionsblandingen når den krævede temperatur. I den automatiske termocykler tager tiden fra blandingens oprindelige temperatur til den ønskede temperatur 30-60 s. Længden af denne forsinkelsestid afhænger af flere faktorer, herunder typen af reaktionsrør, vægtykkelse, volumen af reaktionsblanding, varme kilde (vandbad eller varmeblok), og temperaturforskellen mellem de to trin, som skal være tilstrækkeligt tilvejebragt ved indstilling af den termiske cyklus Vær opmærksom på og overvej, og faktisk måling skal udføres på hvert instrument.
En anden vigtig overvejelse om den termiske cyklustid er afstanden mellem de to primere; jo længere afstanden er, jo længere tid tager det at syntetisere målsekvensens fulde længde. Reaktionstiden angivet ovenfor er baseret på den optimale synteselængde på 500 bp. Målsekvensen tegnes op. Her er en introduktion til valg af forskellige temperaturer.
1. Template-denatureringstemperatur Denatureringstemperaturen bestemmer den temperatur, ved hvilken det dobbeltstrengede DNA smelter i PCR-reaktionen. Hvis denatureringstemperaturen ikke nås, vil der ikke blive produceret en enkeltstrenget DNA-skabelon, og PCR vil ikke starte. Lav denatureringstemperatur betyder ufuldstændig denaturering, DNA-dobbeltstrenget Det vil renaturere hurtigt, hvilket reducerer udbyttet. Generelt 90~95℃. Når prøven når denne temperatur, skal den hurtigt afkøles til udglødningstemperaturen. DNA-denaturering tager kun få sekunder, og det er ikke nødvendigt i lang tid; tværtimod bør du gøre dit bedste ved høj temperatur. Forkort den for at opretholde aktiviteten af Taq DNA-polymerase. Den maksimale denatureringstemperatur efter tilsætning af Taq DNA-polymerase bør ikke overstige 95°C.
2. Primer-udglødningstemperatur Udglødningstemperaturen bestemmer specificiteten og udbyttet af PCR; hvis temperaturen er høj, er specificiteten stærk, men hvis temperaturen er for høj, kan primeren ikke kombineres fast med skabelonen, og DNA-amplifikationseffektiviteten reduceres; temperaturen er lav, udbyttet er højt, men for lavt kan forårsage uoverensstemmelse mellem primer og skabelon. Ikke-specifikke produkter øges. Generelt start med reaktionsbetingelserne på 37 ℃, opsæt en række kontrolreaktioner for at bestemme den optimale udglødningstemperatur for en specifik reaktion. Det kan også udledes baseret på (G+C)%-indholdet af primerne for at forstå testen. Udgangspunktet for den generelle test, udglødningstemperaturen Ta (glødningstemperatur) er 5 ℃ lavere end smeltetemperaturen TTm (smeltetemperatur) af amplifikationsprimeren, som kan beregnes efter formlen:
Ta = Tm-5℃= 4(G{{2}}C){{4}} 2(A+T) -5℃
Blandt dem repræsenterer henholdsvis A, T, G og C antallet af tilsvarende baser. For en primer på 20 baser, hvis indholdet af (G+C)% er 50%, kan startpunktet for Ta indstilles til 55°C. Ved en typisk primerkoncentration (såsom 0,2μmol/L) kan annealingsreaktionen afsluttes på få sekunder, og langtidsannealing er ikke nødvendig.
3. Valget af primerforlængelsetemperatur afhænger af den optimale temperatur for Taq DNA-polymerase. Generelt 70 ~ 75 ℃ kan standardhastigheden for enzymkatalyserede nukleotider ved 72 ℃ nå 35 ~ 100 nukleotider/sek. i minuttet. Længden på 1 kb kan forlænges, og dens hastighed afhænger af sammensætningen af bufferopløsningen, pH-værdi, saltkoncentration og DNA-skabelonens beskaffenhed. Hvis det amplificerede fragment er kortere end 150 bp, kan forlængelsestrinnet udelades, og det bliver en dobbelt temperaturcyklus på grund af Taq DNA. Polymerasen er tilstrækkelig til at fuldføre syntesen af korte sekvenser ved annealingstemperaturen. For korte sekvensfragmenter mellem 100 og 300 bp er det effektivt at bruge en hurtig og enkel dobbelttemperaturcyklus. På dette tidspunkt er primerens forlængelsestemperatur den samme som annealingstemperaturen. For DNA-fragmenter over 1 kb kan forlængelsestiden kontrolleres inden for 1 til 7 minutter i henhold til fragmentets længde. Samtidig skal gelatine eller BSA-reagens tilsættes til PCR-bufferen for at holde Taq DNA-polymerasen aktiv og stabil i lang tid. Køn; 15%-20% glycerol hjælper med at amplificere omkring 2,5 kb eller længere DNA-fragmenter.
4. Antallet af cyklusser af konventionel PCR er generelt 25 til 40 cyklusser. Den generelle fejl er, at antallet af cyklusser er for meget, den uspecifikke baggrund er alvorlig, og kompleksiteten øges. Selvfølgelig er antallet af reaktionscyklusser for lille, og udbyttet er lavt. Derfor er det nødvendigt at sikre, at produktet opnås. Under forudsætningen af hastighed bør antallet af cyklusser minimeres.
Efter at amplifikationen er afsluttet, afkøles prøven og opbevares ved 4°C.
2. Primer Primer Design
For at amplificere template-DNA skal du først designe to oligonukleotidprimere. De såkaldte primere er faktisk to oligonukleotidfragmenter, der er komplementære til mål-DNA-sekvensen, der skal amplificeres. Afstanden mellem de to primere bestemmer længden af det amplificerede fragment. , De 5'-ender af de to primere bestemmer positionerne af de to 5'-ender af det amplificerede produkt. Det kan ses, at primerne er nøglen til at bestemme længden, positionen og resultaterne af de PCR-amplificerede fragmenter, og primerdesignet er vigtigere.
Den nødvendige betingelse for primerdesign er, at mål-DNA-sekvensen komplementær til primeren skal være kendt. Sekvensen mellem de to primere er ikke nødvendigvis klar. De to kendte sekvenser er generelt 15-20 baser, som kan syntetiseres med en DNA-synthesizer. Svarende til to komplementære primere omfatter de principper, der generelt følges i primerdesign, desuden:
1. Primerlængden beregnes i henhold til statistik, og sandsynligheden for, at en oligonukleotidsekvens på omkring 17 baser kan optræde i det humane genom, er én gang. Derfor er primerlængden generelt ikke mindre end 16 nukleotider, og den højeste ikke mere end 30 nukleotider, og den bedste længde er 20-24 nukleotider. Sådanne korte oligonukleotider vil ikke danne en stabil hybrid ved polymerisationstemperaturen (passer 72°C). Nogle gange kan det være ved 5' Tilføj sekvenser, der ikke er komplementære til skabelonen i slutningen, såsom restriktionsenzymsteder eller promotorer, for at fuldføre genkloning og andre særlige behov; primer 5'endebiotinmærket eller fluorescerende mærke kan bruges til forskellige formål, såsom mikrobiel detektion.
Nogle gange virker primeren'ikke, årsagen er ukendt, du kan flytte positionen for at løse den.
2. Sammensætningen af (G+C)% indholdsprimere skal være ensartet og forsøge at undgå at indeholde den samme basispolymer. (G+C)%-indholdet i de to primere skal være så ens som muligt, i det kendte amplificerede fragment (G+C) %-indhold skal være tæt på det fragment, der skal amplificeres, generelt 40% til 60% er bedre.
3. Indersiden af primeren bør undgå dannelsen af tydelige sekundære strukturer, især hårnålestrukturer. For eksempel:
4. Der bør ikke være nogen komplementering mellem de to primere mellem primerne, især ved 3'enden af primeren. Selvom det ikke kan undgås, bør den 3'ende komplementære base ikke være større end 2 baser, ellers er det let at danne en"primer dimer" Eller"Primer dimer" (Primer dimer). Den såkaldte primer-dimer er i det væsentlige et dobbeltstrenget DNA-fragment dannet ved forlængelse af en primer på den anden primersekvens under påvirkning af DNA-polymerase. , Er et almindeligt biprodukt af PCR, og bliver nogle gange endda hovedproduktet.
Undgå desuden homologe sekvenser mellem de to primere, især oligonukleotidfragmenter med mere end 6 på hinanden følgende identiske baser, ellers vil de to primere konkurrere med hinanden om det samme sted i skabelonen; på samme måde kan primerne og mål-DNA'et, der skal amplificeres. Eller andre sekvenser af prøve-DNA'et kan ikke have homologe sekvenser på mere end 6 baser. Ellers vil primerne binde til andre steder, hvilket reducerer specifik amplifikation og øger ikke-specifik amplifikation.
5. Primer 3'endeparring af DNA-polymerase tilføjer et enkelt nukleotid til 3'enden af primeren. Derfor skal parringskravene for 5-6 baser fra 3'enden af primeren og mål-DNA'et være præcise og strenge for at sikre effektiv PCR-amplifikation. .
Om primerdesignet er rimeligt kan verificeres ved computersøgning ved hjælp af PCRDESN-software og amerikansk PRIMER-software.
Kunstigt syntetiserede oligonukleotider bør fortrinsvis oprenses ved kromatografi (kromatografi) eller PAGE for at fjerne urenheder såsom korte kæder, der ikke er blevet syntetiseret til fuld længde. Oprensede primere opbevaret i 25 % acetonitrilopløsning ved 4°C kan forhindre mikroorganismer Under normale omstændigheder skal ubrugte primere opbevares i køleskab ved -20°C. Primerne kan opbevares i væske i 6 måneder og kan opbevares i 1 til 2 år efter lyofilisering.
