Princippet i PCR er at bruge DNA, der denaturerer og bliver enkeltstrenget ved en høj temperatur på 95°C in vitro. Ved lave temperaturer (normalt omkring 60°C) kombineres primerne og enkeltstrengene efter princippet om basekomplementær parring, og derefter justeres temperaturen til DNA-polymerase. Ved den optimale reaktionstemperatur (omkring 72°C) syntetiserer DNA-polymerase komplementære strenge langs phosphorsyrens retning til fem kulstofsukkere (5'-3').
Det mest værdifulde anvendelsesområde for PCR er diagnosticering af infektionssygdomme. I teorien kan PCR påvises, så længe der er et patogen i prøven.
I forsøg har man fundet ud af, at DNA også kan denatureres og smeltes ved høje temperaturer, og det kan renatureres til dobbeltstrenget igen, når temperaturen sænkes. Ved at kontrollere denatureringen og renatureringen af DNA ved temperaturændringer kan tilføjelse af designprimere, DNA-polymerase og dNTP'er derfor fuldføre in vitro-replikationen af specifikke gener.
DNA-polymerase vil dog blive inaktiveret ved høje temperaturer. Derfor skal der til hver cyklus ny DNA-polymerase, hvilket ikke kun er besværligt at betjene, men også dyrt, hvilket begrænser anvendelsen og udviklingen af PCR-teknologi.
